Bei der als Genrettung bekannten direkten Selektionstechnik werden auxotrophe Mutanten als Wirte für Vektoren eingesetzt, die ein Biosynthesegen tragen. Wenn beispielsweise das A-Gen für die Tryptophan-Synthase in einer trp A--auxotrophen Mutante kloniert wird, können nur solche Zellen Kolonien auf einem Nährmedium bilden, dem Tryptophan fehlt, die eine vom Plasmid abstammende Kopie des A-Gens enthalten. Wenn das klonierte Gen exprimiert wird, kann auch direkt nach dem Genprodukt selektioniert werden. Dieses kann z. mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. rekombinante DNA-Technik. Abb. 1. Was ist eine Knockout-Maus? - MedizinDoc - Tipps für mehr Gesundheit. In-vitro -Erzeugung eines chimären Plasmids, das fremde DNA enthält. Die benötigten klebrigen Enden werden durch Spaltung sowohl des Plasmids als auch der fremden DNA mit der gleichen Restriktionsendonuclease (in diesem Fall EcoRI) gebildet. 2. Die klebrigen Enden werden mit Hilfe terminaler Transferase und eines geeigneten Desoxyribonucleotidtriphosphats gebildet. 3. Screening-Verfahren von Grunstein und Hogness zur Identifizierung einzelner rekombinanter Bakterienkolonien.
Wenn Vektor und Donor-DNA mit dem gleichen Enzym gespalten werden, sind die Enden komplementär und können hybridisiert und dann durch eine DNA-Ligase ( Polynucleotid-Ligase) kovalent verknüpft werden (Abb. 1). Ein solch einfaches Verknüpfen von zwei DNA-Fragmenten ist nicht immer möglich, wenn z. B. 1) das Restriktionsenzym stumpfe Enden bildet; 2) es vielleicht notwendig ist, unterschiedliche Restriktionsenzyme einzusetzen, so dass die potenziellen klebrigen Enden nichtkomplementär sind; 3) die DNA-Fragmente durch mechanisches Scheren, enzymatische cDNA-Synthese oder chemische DNA-Synthese hergestellt wurden und keine klebrigen Enden besitzen. Es ist in solchen Fällen jedoch möglich, klebrige Enden zu erzeugen (Abb. 2), indem Nucleotidschwänze an das 3'-Ende von DNA-Ketten mit Hilfe von terminaler Transferase aus Kalbsthymus addiert werden (sog. tailing). Lösungsvorschlag. Alternativ dazu können synthetische DNA-Linker an den Vektor und/oder die Donor-DNA ligiert werden. Der Linker besteht aus einem kurzen DNA-Fragment, das die Erkennungssequenz von einem oder mehreren Restriktionsenzymen enthält, die in der DNA, die den Linker erhält, nicht enthalten sind.
Abweichende Phänotypen in knockout-Mutanten. Wildtyp und transformierte Pflanzen wurden auf Minimalmedium (Knop Medium) angezogen, um Differenzierung und Gametophoren zu induzieren. Je Pflanze ist eine Übersicht (obere Reihe, Größenbalken: 1 mm) und eine Nahaufnahme (untere Reihe, Größenbalken: 0. 5 mm) gezeigt. A: haploide Wildtyp-Moospflanze, die komplett mit Gametophoren bedeckt ist, sowie eine Nahaufnahme eines Blättchens. B-D: verschiedene Mutanten. [1] Homologe Rekombination Die homologe Rekombination (HR) tritt bei allen Organismen auf. Voraussetzung sind homologe, doppelsträngige DNA-Abschnitte. Homolog heißt, dass es große Ähnlichkeiten in der Nucleotidsequenz gibt. Bei Doppelstrangbrüchen kann durch homologe Rekombination der Schaden ausgebessert werden, indem die Informationen auf dem unbeschädigten Chromatid als Vorlage genutzt wird. HR ist also ein Werkzeug der Zelle, um Genmutationen zu reparieren. Künstliche dna recombination technology. Homologe Rekombinationen laufen meist nach folgendem Schema ab: Parallele Annäherung ("Paarung") zweier doppelsträngiger DNA-Moleküle, so dass die Bereiche ähnlicher (homologer) Nucleotidsequenzen auf gleicher Höhe liegen.
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